結直腸癌組織中受體酪氨酸激酶EphB3的表達下調分子機制和臨床意義研究(碩士

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資料介紹:

結直腸癌組織中受體酪氨酸激酶EphB3的表達下調分子機制和臨床意義研究(碩士)(論文25000字)
中文摘要
研究背景:產促紅細胞生成素肝細胞癌受體(Erythropoietin-producing human hepatocellular carcinoma,Eph)基因是至今為止人類最大的受體酪氨酸激酶亞家族,其在人體正常生長發育,特別是神經脈管系統發育中發揮重要作用。同時,在人類多種疾病包括某些惡性腫瘤的發生、發展和預后中也具有重要作用。Eph基因包括至少8種配體(ephrin)和14種受體(Eph),配體和受體都分別包含A和B兩類。與其他酪氨酸激酶受體一樣,細胞膜上Eph受體蛋白和鄰近細胞膜上的ephrin配體結合,引發一系列細胞信號傳導作用,導致細胞內的酪氨酸激酶磷酸化,并進一步激化下游多種蛋白分子,發揮正常生理或病理作用。雖然,已經有少量關于EphB3受體在結直腸癌(colorectal cancer, CRC)細胞中的表達研究,他們的研究發現與正常的腸道上皮細胞相比,EphB3在結腸直腸癌細胞中表達水平降低。但至今為止,EphB3在CRC的表達和臨床病理參數之間的關系還不清楚。
研究方法:首先,從上海細胞庫等購買了腸癌細胞系HCT116、HT29、SW480和SW620進行細胞培養,利用細胞免疫組化染色和Western blot對腸癌細胞系的EphB3蛋白表達進行了檢測。接著,從醫院病理科檔案室選取了128個經過病理檢查證實的結直腸癌的石蠟固定組織標本和19個腸腺瘤標本,并收集其臨床病理資料,以及電話隨訪患者生存信息。購買了針對EphB3受體的特異性抗體,使用免疫組織化學染色方法檢查了這組標本中EphB3蛋白的表達。當發現與同一患者正常腸黏膜細胞比較,EphB3在腫瘤細胞中表達下調的現象后,采用甲基化特異性PCR(MSP)分析了腸癌細胞系中EphB3啟動子區甲基化狀態。由于微衛星不穩定性(MSI)、KRAS基因突變和BRAF基因突變在結直腸癌發生、進展和治療中具有重要作用,因此,應用現代分子生物學技術分析了這組標本中的MSI狀態,KRAS和BRAF突變情況,并分析了它們與EphB3表達的相關性。最后,用Sperman等級相關性和Kaplan–Meier生存分析方法分別對EphB3表達與臨床病理參數和患者生存情況之間的相關性進行了統計學分析。
實驗結果:檢測的128例結直腸癌組織樣本中,EphB3蛋白在正常腸粘膜上皮細胞(128/128)和腺瘤細胞(19/19)中都強陽性表達。在CRC的腫瘤細胞中, EphB3的表達表現為多種形式,其中陰性或弱陽性表達為41.4%(53/128),中度陽性表達為26.6%(34/128),強陽性表達為32.0%(41/128)。統計學分析發現EphB3表達與腫瘤侵犯深度 (P =0.016,rs =−0.213),淋巴結轉移(P = 0.000,rs =−0.490),和TNM分級(P = 0.000,rs =−0.390) 呈負相關;與分化程度 (P = 0.001,rs =0.290),BRAF V600E突變(P =0.008, rs =0.235)和總生存期(P< 0.001)呈正相關。在多變量分析發現,EphB3表達(P=0.007)和淋巴結轉移(P<0.001)為患者生存時間的獨立預后因子。在腸癌細胞株和部分CRC組織中檢測到EphB3啟動子區的超甲基化。因此,推斷在CRC中與正常的粘膜相比,EphB3在腸癌組織中表達下調,CpG島的超甲基化可能是CRC EphB3下調的重要分子調控機制。
研究結論:在結直腸癌中,甲基化導致EphB3的表達下調,EphB3蛋白可能是一個潛在的預后指標。

Abstract
Although EphB3 expression is down-regulated in colorectal cancer (CRC) cells compared with normal intestinal epithelial cells,the relationship between EphB3 expression and clinicopathological parameters in CRC is unclear.We examined EphB3 expression in 128 CRC tissue specimens and in 19 adenoma specimensusing immunohistochemistry. The relationships between EphB3 expression and clinicopathological parameters, KRAS mutations, BRAF V600E mutation, MSIand survival wereevaluated using Spearman’s rankcorrelation and Kaplan–Meier survival analyses, respectively.CpG methylation in the EphB3 promoter was examined in four human CRC cell lines and tissues. EphB3 was strongly expressedin all normal intestinal epithelial cells (128/128) and adenoma cells (19/19). In CRC tumor cells, EphB3expression was negative or weak in 41.4% (53/128), moderate in 26.6% (34/128), and strong in 32.0% (41/128) of samples. EphB3 expression was negatively associated with invasive depth (P = 0.016, rs = −0.213), lymph node metastasis (P = 0.000, rs = −0.490), and TNM stage (P = 0.000, rs = −0.390),and waspositively associated with poor differentiation(P = 0.001, rs = 0.290),BRAF V600E mutation (P = 0.008, rs = 0.235), and longer overall survival (P < 0.001). In multivariate analysis, EphB3 expression (P = 0.007) and lymph node metastasis (P < 0.001) were independent prognostic factors for poor survival. Hypermethylation of the EphB3 promoter was detected in cell lines and CRC tissues. EphB3 is down-regulated in CRC compared to normal mucosa. Hypermethylation of CpG island is contributed to downregulation of EphB3 in CRC. EphB3 expression in tumor cells may be a useful prognosticindicator for patients with CRC.

目錄
正文    6
一、 實驗材料、試劑和實驗設備    6
1. 大腸癌細胞系、細胞培養試劑、設備    6
2. 結直腸癌組織標本石蠟固定和病理切片設備    7
3. 抗體和免疫組化設備    7
4. Western blot    7
5. 甲基化檢測試劑和設備    7
6. 微衛星不穩定性檢測試劑盒和設備    8
7. KRAS突變檢測試劑盒和設備    8
8. BRAF突變檢測試劑盒和設備    8
二、 實驗方法    8
1. 細胞培養    8
2. 細胞免疫化學染色    8
3. Western blot    8
RIPA裂解液配制    8
150 mM NaCl    8
細胞總蛋白提取    9
制備雙層PAGE膠    9
A/下層膠    9
B/上層膠(stack gel 5%)    9
上樣    10
轉膜    10
抗體反應及顯色    10
三、 實驗結果    16
1. 大腸癌細胞EphB3表達    16
2. 腸癌細胞EphB3基因CpG島甲基化    18
3. 結直腸癌組織中EphB3表達    18
4. 結直腸癌組織EphB3表達的臨床意義    19
5. 結直腸癌組織MSI狀態及EphB3表達與MSI相關性分析    20
6. 結直腸癌組織EphB3表達與KRAS突變相關性分析    21
7. 結直腸癌組織EphB3表達與BRAF突變相關性分析    21
8. 結直腸癌組織EphB3表達與患者生存時間的相關性    22
四、討論    23
五、結論    25
六、參考文獻:    25

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